Barral, P. 等人。 （2010）。 CD169(+)巨噬细胞呈递脂质抗原，介导淋巴结中iNKT细胞的早期激活。自然免疫学。 11（4）：303-12。 [PubMedID:20228797]

在过去十年中，NKT 细胞已成为宿主防御微生物感染的基本要素，形成适应性免疫和先天免疫之间的界面。 NKT 细胞对 CD1d 中呈现的糖脂抗原（例如模型抗原 α-GalCer）做出反应。 NKT 细胞生物学快速发现的关键是能够使用 CD1d 四聚体操纵和监测 NKT 细胞。

Barral 等人研究了 NKT 细胞在免疫反应发生过程中何时何地遇到其同源抗原的问题，他们的全面研究为 NKT 细胞激活的动态提供了令人兴奋的新见解。

表征为了研究体内淋巴结 (LN) 中 NKT 细胞的动态，研究小组通过流式分选用装载 α-GalCer 的 CD1d 四聚体染色的细胞分离了 NKT 细胞；然后他们对纯化的细胞进行荧光标记并将其转移到宿主小鼠体内。完整 LN 的成像显示 NKT 细胞的行为类似于 CD4+ T 细胞，在其环境中随机行走。为了刺激 NKT 细胞，给小鼠注射了 α-GalCer 包被的二氧化硅颗粒。刺激导致 LN 内标记的 NKT 细胞速度降低。这种减慢取决于抗原呈递，因为当使用 CD1d 缺陷小鼠来宿主标记的 NKT 细胞时，没有观察到这种情况。

哪些 CD1d 阳性细胞向 LN 中的 NKT 细胞呈递抗原，并导致其保留？为了缩小候选范围，研究小组跟踪了过继转移的 NKT 细胞的运动以及荧光标记的颗粒脂质的运动。使用流式细胞术对这个复杂的实验进行了详细分析和 LN 成像。将这些分析放在一起（见图 1）Barral 等人得出结论，CD169+ 巨噬细胞介导 NKT 细胞停滞，与它们形成特异性且持久的接触。

图 1. NKT 细胞在 SCS CD169+ 巨噬细胞上停滞。两部不同电影（顶部和底部）的延时图像显示 α-GalCer（红色）注射后 6 小时，NKT 细胞（箭头）与 CD169+ 巨噬细胞（绿色）接触。时间戳的单位是 mm:ss。比例尺，20 μm（顶部），15 μm（底部）。数据代表六个实验。

为了确定 CD169+ 巨噬细胞的能力，使用氯膦酸盐脂质体处理来去除 LN 的巨噬细胞。将抗原注射到治疗小鼠体内未能诱导 NKT 细胞完全激活和扩增。研究人员表明 CD169+ 巨噬细胞表达 CD1d，并且能够处理 α-GalCer 类似物以呈递给 NKT 细胞。流式分选和 α-GalCer 脉冲的 CD169+ 巨噬细胞能够在体外激发原代 NKT 细胞的 IFNgamma 分泌和增殖，有力地表征了它们能够通过 CD1d 将模型糖脂抗原呈递给 NKT 细胞。

正如这项研究表明，可靠的试剂（例如 ProImmune 的 CD1d 四聚体、组合）的广泛使用通过优雅的实验设计，可以获得有关我们生物学的大量新信息。

图片经 Macmillan Publishers Ltd 许可改编：自然免疫学

Engkilde, K. 等人。 （2010）。通过反复接触引起亚临床皮炎的接触过敏原来预防 NOD 小鼠的糖尿病。公共科学图书馆一号。 11;5(5):e10591.[PubMedID:20485668]

Johansen 实验室此前发表了他们对 I 型糖尿病和过敏性接触性皮炎发病率之间负相关关系的观察结果。 (Engkilde, K.等人(2006).Diabetologia.49(4):644-7.PubMedID:16491393)Engkilde等人的下一个合乎逻辑的步骤是研究这种预防糖尿病的机制。当他们开始发现 NKT 细胞可能是他们观察到的接触性皮炎保护作用的根源时，他们转向 ProImmune 来缓解将 CD1d 四聚体应用于 NKT 细胞监测。

非肥胖糖尿病 (NOD) 小鼠被研究人员广泛用作研究 I 型糖尿病的模型，因为雌性小鼠从 12 周龄起就会患上糖尿病。 I 型糖尿病是由 Th1 型细胞因子驱动的胰岛素分泌胰腺 B 细胞破坏引起的。相比之下，过敏性疾病是由偏向 Th2 的细胞因子反应介导的。由于 Th1 和 Th2 反应是相互抑制的，因此引发过敏性接触性皮炎等 Th2 反应可能可以预防糖尿病似乎是合乎逻辑的，但造成这种联系的细胞性质仍不清楚。

Engkilde 等人通过在耳朵上重复使用对苯二脒 (PPD) 或 2, 4-二硝基氯苯 (DNCB)，在 NOD 小鼠中诱发了相对轻微的过敏性接触性皮炎。如图 1 所示，与接受 DN 的小鼠相比，接受重复 PPD 应用的小鼠糖尿病发病率大约减半CB、仅单剂 PPD 或仅水。 DNCB 缺乏效果的原因可能是使用了相对较高的剂量，这可能使小鼠在首次使用时产生耐受：未来，团队计划探索较低剂量的效果。

图2.重复应用PPD可抑制NOD小鼠糖尿病的发展。该图显示了四组小鼠糖尿病发病率的卡普兰-迈耶曲线。 DNCB-rep、PPD-rep 和水，是指每隔一周重复暴露于 DNCB、PPD 或水的小鼠组。 PPD-induc 是指仅在生命第四周时暴露于 PPD 的小鼠组。反复接触 PPD 的 NOD 小鼠的糖尿病累积发病率为 47%，而水处理组的这一数字为 93%（P=0.004）。对所有显示的曲线进行对数秩检验，显着性为 P=0.008。

对小鼠耳朵进行的组织病理学显示，反复暴露的小鼠有明显的淋巴细胞浸润。到 PPD。为了进一步探索这一观察结果，研究人员通过两轮接触性过敏原的应用，在 10 周大的小鼠群体中诱发了接触性皮炎。然后用 ProImmune 的小鼠 CD1d 四聚体染色后，通过流式细胞术分析肝脏和耳淋巴结中的 NKT 细胞数量。他们的结果是惊人的。如图2所示，第二次PPD应用后，耳廓淋巴结中的NKT细胞数量显着增加。

图 3. 局部暴露刺激耳廓淋巴结中的 NKT 细胞沙漠耳廓淋巴结 (A-LN) 中 NKT 细胞的数量。对 A-LN 细胞进行门控以排除死细胞，并收集 300,000 个细胞的样本数据。可以看出，两种过敏原都会刺激 A-LN 中的 NKT 细胞，尽管 PPD 似乎是更强或更长的刺激剂。细胞数量的增加随后急剧下降，这可能是由于先前报道的 T 细胞受体的下调所致。 Mann-Whitney U 检验是对与对照组（0 小时）相关的 NKT 数量进行的检验，得出显着的结果（z=−2.095，P<0.05）。

数据强烈表明NKT 细胞在介导 1 型糖尿病发作的保护作用中发挥着作用。最终，这项工作可能会导致制定延迟或避免遗传性自身免疫性疾病发作的策略。因此，ProImmune 的 CD1d 四聚体在有价值的糖尿病研究的前沿发挥着重要作用。

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Porubsky, S. 等人。 （2007）。异球三己糖神经酰胺 (iGb3) 缺陷小鼠中不变自然杀伤 T 细胞的正常发育和功能。美国国家科学院院刊。 104：5977-5982。 [PubMedID: 17372206]

该研究旨在发现 iGb3 是否是小鼠中生理相关的选择配体，因为它之前被间接暗示为负责胸腺中 iNKT 阳性选择的内源配体。波鲁布斯基等人。使用 ProImmune 装载 α-GalCer* 的小鼠 CD1d 四聚体来测定缺乏 iGb3 合酶的小鼠胸腺、脾脏和肝脏中的 iNKT 细胞频率。他们得出的结论是，iGb3 不是体内生理相关的胸腺 iNKT 选择配体。

图 4. 胸腺细胞、脾细胞和将 8 至 10 周龄 iGb3S+/- 和 iGb3S-/- 小鼠的肝白细胞用抗 CD19 和抗 CD44 抗体染色，并用加载 α-GalCer 的 CD1d 四聚体染色以可视化 iNKT 群体，或用未加载的 CD1d 四聚体染色以定义非特异性结合的量。绘图对淋巴细胞进行门控。对于脾脏，CD19+ 细胞已被门控出。数字表示淋巴细胞门控中 CD1d 四聚体+/CD44+ 细胞的百分比 + SEM；n=5。版权所有（2007 年） ) 美国国家科学院。

Mallevaey, T. 等人. (2007). 恒定和非恒定自然杀伤 T 细胞在鼠血吸虫病期间对免疫反应发挥相反的调节功能。感染与免疫本质。 75(5)：2171-2180。 [PubMedID: 17353286]

里尔巴斯德研究所的 Thierry Mallevaey 等人使用 ProImmune 的 CD1d 四聚体分析两种不同 NKT 菌株中 iNKT 细胞和非 iNKT 细胞群体的比例-感染曼氏血吸虫寄生虫之前和之后的细胞缺陷小鼠。研究发现，无论分析的时间点如何，CD3+ NK1.1+ 群体中四聚体阳性（iNKT）和四聚体阴性（非 iNKT）细胞的比例保持不变，从而得出结论：感染后 3 周，种群被激活。数据表明，iNKT 和非 iNKT 细胞亚群在鼠血吸虫病期间对 Th1/Th2 平衡具有相反但可能是互补的影响。

图 5. 曼氏沙门氏菌感染期间脾脏 NKT 细胞活化分析。在感染后的不同时间点收获脾脏，并通过流式细胞术染色评估可检测的CD3+ NK1.1+细胞的频率和绝对数量。此处显示的是总 CD3+ NK1.1+ 细胞（注射后 0 周和 7 周，左）以及 CD3+ NK1.1+ 细胞中四聚体+和四聚体-细胞（右）的代表性点图。版权所有 (2007) 美国微生物学会

Fedeli, M. 等人。 （2009）。 Dicer 依赖性 microRNA 通路控制不变的 NKT 细胞发育。 J免疫学。 183(4)：2506-2512。 [PubMedID: 19625646]

MicroRNA (miRNA) 是 RNA 的短非编码区域，通过与编码 mRNA 的互补蛋白结合来调节基因表达。成熟 miRNA 的加工由细胞质中的 RNase II 酶 Dicer 控制，该酶随后影响多种细胞类型（例如 B 和 T 淋巴细胞）的发育途径。费德利等人。研究了 miRNA 是否参与控制 CD1d 依赖的不变自然杀伤 T (iNKT) 细胞发育。

ProImmune 的小鼠 CD1d 四聚体用于对删除一个或两个 Dicer 基因的条件敲除小鼠的细胞进行染色。结果表明，与野生型同窝小鼠相比，Dicer 基因的删除导致胸腺和外周器官中 iNKT 细胞的频率显着降低，而 T 细胞谱系不受 Dicer 删除的影响。这表明 Dicer 依赖性 miRNA 在特定 iNKT 细胞分化过程中的重要作用。进一步的研究表明，Dicer-/- 小鼠中缺乏可检测到的 iNKT 细胞是由于细胞死亡增加所致。

图 6.Dicer 敲除小鼠胸腺和外周器官的 CD1d 四聚体染色显示，与野生型同窝小鼠相比，iNKT 细胞数量较少。

综合这些数据，推进了我们对iNKT 细胞的分化途径以及它们与已描述的 T 细胞谱系有何不同。

Dr. RegImmune Inc.（美国）的 Omar Duramad 使用 ProImmune 的 R-PE 标记的预载 α-GalCer 的人 CD1d 四聚体对非人灵长类恒河猴的 PBMC 进行染色。用 RGI-2001（脂质体 α-GalCer，NKT 细胞的配体）刺激恒河猴的 PBMC 3 天，然后进行 CD1d 四聚体染色。细胞还用抗 CD3 PerCP Cy 5.5 单克隆抗体染色，并对活的 CD3 阳性细胞进行门控。

图 7. 在用 RGI-2001 刺激的 PBMC 中，2.93% 的 CD3+ 细胞呈 CD1d 阳性，而在未经处理的对照样品中，只有 0.31% 的 CD3+ 细胞呈 CD1d 阳性。 CD3+ 细胞呈 CD1d 阳性。

因此，ProImmune 的人类 CD1d 四聚体可以作为加强恒河猴研究的有用工具。